NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT MẪU NGOẠI KIỂM NHUỘM SOI, ĐỊNH DANH VÀ KHÁNG NẤM ĐỒ CHO CÁC LOẠI NẤM MEN

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT MẪU NGOẠI KIỂM NHUỘM SOI, ĐỊNH DANH VÀ KHÁNG NẤM ĐỒ CHO CÁC LOẠI NẤM MEN

05.06.2024 506

Vũ Thị Bích Hồng, Nguyễn Xuân Đạt, Nguyễn Thúy Hà, Phan Văn Hiếu

Hàng năm, trên thế giới có khoảng 300 triệu người nhiễm bệnh nấm, với con số tử vong lên đến 1,6 triệu người. Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong lĩnh vực xét nghiệm chẩn đoán nấm gây bệnh, tuy nhiên, thực tế vẫn còn gặp nhiều thách thức do chất lượng xét nghiệm nấm gây bệnh phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như kỹ thuật, con người, hóa chất, thiết bị… Do vậy, sử dụng bộ mẫu ngoại kiểm tra chất lượng nấm bệnh là vô cùng cần thiết, cung cấp bằng chứng khách quan về năng lực thực hiện xét nghiệm và được các cơ quan quản lý yêu cầu thực hiện. Hiện nay ở nước ta, nguồn mẫu ngoại kiểm nấm đang được cung cấp bởi một tổ chức nước ngoài. Việc này dẫn đến nhiều vấn đề như chưa kiểm soát hết các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng mẫu bởi điều kiện vận chuyển, khó khăn trong việc làm thủ tục mua bán, báo cáo và tiếp nhận kết quả đánh giá, đặc biệt giá thành cao khiến cho nhiều đơn vị xét nghiệm chưa tiếp cận được.

Với vai trò là đơn vị đi đầu trong lĩnh vực quản lý chất lượng xét nghiệm y học và phòng xét nghiệm, vì mục tiêu nâng cao chất lượng xét nghiệm, đưa hoạt động kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm đến từng đơn vị thực hiện công tác xét nghiệm, Trung tâm kiểm chuẩn đã nghiên cứu, sản xuất và đưa vào ứng dụng thực tế các bộ mẫu ngoại kiểm vi sinh, định nhóm máu, HBV – DNA, đông máu… Năm 2021, Trung tâm tiếp tục triển khai thêm đề tài cấp cơ sở “ Nghiên cứu sản xuất mẫu ngoại kiểm nhuộm soi, định danh và kháng nấm đồ cho các loại nấm men” với mục tiêu:

  1. Xây dựng quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm phù hợp với xét nghiệm nhuộm soi, định danh và kháng nấm đồ.
  2. Thử nghiệm và đánh giá chất lượng bộ mẫu khi triển khai ngoại kiểm tra tại các đơn vị.

Nghiên cứu thực nghiệm trong phòng xét nghiệm từ tháng 11/2021 đến tháng 08/2022 trên đối tượng nghiên cứu:

– Chủng chuẩn nấm có nguồn gốc từ ngân hàng chủng chuẩn Hoa Kỳ (American Type Culture Collection – ATCC):  Candida albicans ATCC® 14053TM* (C. albicans®), Cryptococcus neoformans ATCC® 204092TM* (C. neoformans®), Candidas tropicalis ATCC® 1369TM* (C.tropicalis®). Chủng chuẩn nấm Candida auris CDC® B11903 (C. auris®) từ ngân hàng chủng Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ.

– Chủng phân lập từ bệnh phẩm được cung cấp bởi phòng xét nghiệm: C. albicansBN, C. neoformansBN, C. tropicalisBN, C. aurisBN.

Sau khi xác nhận lại chủng của các mẫu cung cấp từ phòng xét nghiệm, pha huyền dịch nấm với độ đục thử nghiệm 0.5 McF, 1 McF, 2 McF, 3 McF. Mỗi độ đục thử nghiệm đều được cấy đếm để kiểm tra mật độ sống trước và sau khi đông khô. 60 lọ mẫu/ chủng đã được sản xuất và đánh giá theo tiêu chuẩn ISO/IEC 13528:2015. Quy trình sản xuất và đánh giá mẫu dung dịch cũng tương tự, tuy nhiên chỉ có 1 mức độ đục thử nghiệm là 0.5 McF. Mẫu huyền dịch nấm được nhuộm soi (soi tươi, nhuộm mực tàu, nhuộm Gram) để đánh giá hình thái ban đầu. Cuối cùng, nhóm nghiên cứu tiến hành thực nghiệm xác định độ ổn định dưới tác động của điều kiện vận chuyển để đánh giá tính khả thi khi ứng dụng kết quả nghiên cứu vào thực tế, triển khia chương trình ngoại kiểm nấm cho các đơn vị trong phạm vi được phân công của trung tâm.

  1. Kết quả xây dựng quy trình sản xuất mẫu đông khô
– Kết quả kiểm tra độ thuần nhất: toàn bộ các lọ chỉ có một loại khuẩn lạc như chủng ban đầu, không có nhiễm chéo. Số lượng khuẩn lạc tối thiểu là 8.8 x 105 CFU/ml thỏa mãn tiêu chuẩn TCVN 9298:2014 (>103 CFU/ml). kết quả định danh và kháng nấm đồ của 4 cặp chủng cũng cho thấy sự đồng nhất kết quả trước và sau đông khô trên từng loại kháng sinh (Fluconazole, Voriconazol, Caspofungin, Micafungin, Amphotericin B, Flucytosine).

– Kiểm tra độ đồng nhất và độ ổn định: Lô mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của ISO/IEC 13528:2015 cả về tính chất vật lý, mật độ sống, duy trì được hình thái đặc trưng của chủng ban đầu, kết quả định danh và kháng sinh đồ.
  1. Kết quả xây dựng quy trình sản xuất mẫu dung dịch
– Kết quả kiểm tra độ thuần nhất: Toàn bộ các lọ chỉ có một loại khuẩn lạc như chủng ban đầu,không có nhiễm chéo

– Kết quả kiểm tra độ đồng nhất: 100% các mẫu cho kết quả hình thái giống với chủng ban đầu.

– Kết quả kiểm tra độ ổn định: Trong môi trường nước muối sinh lý, hình thái của tất cả các chủng thử nghiệm duy trì độ ổn định trong 32 ngày. Ngày 33 của thử nghiệm trên chủng C. neoformans ghi nhận hình ảnh chủng mất dần khả năng chiết quang khi nhuộm mực tàu. Các chủng còn lại cho kết quả không đổi đến hết 40 ngày.

Mẫu dạng đông khô (trái)
Mẫu dạng dung dịch (phải)
  1. Kết quả thực nghiệm xác định độ ổn định trong các điều kiện vận chuyển mô phỏng

Nghiên cứu đã mô phỏng lại các điều kiện khác nhau của quá trình vận chuyển gồm thay đổi nhiệt độ (8 – 45ᵒC), rung lắc, thả rơi… Kết quả mô phỏng thực nghiệm điều kiện vận chuyển cho thấy, vận chuyển mẫu ở điều kiện nhiệt độ ≤ 30ᵒC sẽ đảm bảo tính ổn định của các sản phẩm là tốt nhất. Các điều kiện khác như rung lắc, thả rơi… trong thử nghiệm không cho thấy có sự tác động đến tính ổn định của sản phẩm.

4. Ứng dụng thực tế

Bộ mẫu đã được thử nghiệm thực tế tại 21 phòng xét nghiệm. Khi so sánh với các tiêu chí đánh giá đưa ra, kết quả cho thấy có tới >95% tổng số xét nghiệm nấm tại các phòng xét nghiệm đạt tiêu chuẩn. Đề tài đã được hội đồng khoa học thông qua 02 tiêu chuẩn cơ sở TCCS 06:2022/TTKC và TCCS 07:2022/TTKC cho các tiêu chuẩn khi triển khai ngoại kiểm.

Như vậy, nhóm nghiên cứu đã hoàn thiện xây dựng quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm phù hợp với xét nghiệm nhuộm soi, định danh, kháng nấm đồ. Trong tương lai, nhóm nghiên cứu tiếp tục mở rộng nghiên cứu với nhiều chủng nấm khác trong khoảng thời gian dài hơn và sớm ứng dụng kết quả vào thực tế, làm chủ nguồn mẫu và tạo điều kiện thuận lợi cho các cơ sở thực hiện xét nghiệm tham gia vào chương trình ngoại kiểm.

02435747248
02435747248